Mikroteknik
MAKALAH
MIKROTEKNIK
Mata Kuliah : Mikroteknik
Dosen : Dr. Ruqiah Ganda Putri Panjaitan
OLEH
RAHMAN PAHWADI
F 051 08 005
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS TANJUNGPURA
PONTIANAK
2011
MIKROTEKNIK
A. PENGERTIAN
Mikroteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989). Sedangkan menurut Amar (2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/ prosedur pembuatan preparat mikroskopik.
Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis (Zaifbio, 2010)
Organ adalah susunan dari bagian organisme, yang tujuannya melakukan fungsi tertentu ataupun kesatuan yang erat kaitannya. Dengan demikian pembuluh darah adalah organ yang fungsinya membawa atau mengalirkan darah. Hati adalah organ yang mempunyai banyak fungsi, akan tetapi sebagai kesatuan fungsi maka hati ini erat kaitannya dengan pencernaan dan asimilasi makanan (Gunarso, 1989).
Jaringan adalah kumpulan sel yang mempunyai fungsi tertentu yang khas bagi perkembangannya. Sebagai conth jaringan epitelia dapat terdiri dari satu atau beberap lapisan sel yang telah berkembang dan membantuk lapisan penutup, jenis jaringan lainnya, jaringan otot terdiri dari sel-sel yang reka membentuk otot (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
B. JENIS BAHAN SEDIAAN DAN CARA PENGAMBILAN SPESIMEN
1. Jenis Bahan Sediaan
Setiap organisme hidup ataupun hasil pertumbuhannya merupakan suatu sumber yang penting sebagai bahan mikoteknik. Bakteri serta berbagai jenis organisme uniseluler lainnya dapat termasuk di dalamnya, karena mereka sangat sering dijumpai erat hubungannya baik dengan jenis jaringan yang masih hidup maupun yang telah mati.
Untuk klasifikasi praktis, bahan yang berasal dari hewan atau tumbuh-tumbuhan dapat dibedakan sebagai bahan yang lunak dan keras, normal atau yang bersifat patologis. Suau spesimen mungkin saja berisi campuran jaringan lunak dan keras, sedang bagian darinpadanya dapat normal dan bagian lain justru patologis sifatnya seperti halnya tumor pada tulang. Pada umumnya suatu jaringan lunak dapat diproses untuk pembuatan sayatan tanpa perlakuan khusus guna mengeluarkan atau melunakkan bagian-bagian yang keras. Dari sekian banyak jaringan hewan, maka kelanjar, tulang rawan yang tidak berkalsium, kulit, otot, saraf dan saluran darah adalah contoh-contoh jaringan lunak. Sedangkan tulang gigi, tulang rawan berkalsium, kitin dan berbagai struktur pada kulit seperti sisik, tangkai bulu dan lempengan kapur termasuk jaringan keras.
Jaringan tumbuhan berbeda dengan jaringan hewa dalam satu hal penting, yaitu bahwa setiap sel tumbuhan terbungkus dalam membran yang cukup tangguh yang terutama terdiri dari selulosa. Membran tersebut berasal dari sel, sedang membran sitoplasma yag asli, yang sesuai dengan membran luar pada sel hewan, berada sedikit di sebelah dalamnya (Gunarso, 1989).
2. Cara Pengambilan Spesimen
Spesimen berasal dari hewan maupun tumbuhan besar biasanya dipotong dalam ukuran yag sesuai untuk dipakai pada penyayatan selanjutnya. Untuk keperluan tertentu seringkali diperlukan spesimen berukuran dalam centimeter, namun spesimen dalam ukuran kecil akan memberikan hasil yang lebih baik.
Pada waktu membedah dan memisahkan spesimen dari jaringan.organ dan organisme,hendaknya dilakukan dengan hati-hati untuk menghindarkan terjadinya luka,kerusakan maupun sobekan.pemotongan sebaiknya menggunakan pisau silet bermata satu.jika skalpel yang dipakai,gunakanlah skalpel yang tajam.bila menggunakan gunting untuk memotong, maka tempat pemotongan biasanya terjadi kerusakan yang memerlukan trimming (perautan) sedikit demi sedikit dengan silet (Gunarso, 1989).
a. Spesimen berasal dari hewan
Jaringan hewan dapat diambil dari mahluk tersebut selagi masih dalam keadaan hidup,setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan segera mungkin dimasukkan larutan fiksatif.organ-organ yang halus sifatnya seperti hatu,jantung,buah pinggang maupun testis tikus atau kelinci dapat secara utuh langsung dimasukkan kedalam larutan fiksatif sebelum dipotong atau disayat dalam ukuran yang sesuai.Untuk usus,bila dikehendaki pemotongan dengan ukuran lebih dari satu sentimeter panjangnya,maka sebaiknya dilakukan penginjeksian larutan fiksatif kedalam lumen usus tersebut agar lapisan mukosa di dalamnya dapat terfiksasi dengan baik.Jenis otot maupun saraf sebaiknya direntang pada waktu fiksasi.Untuk itu,dapat dipakai misalnya batang gelas berbentuk U.tulang vertebrata yang berukuran kecil dapat difiksasi secara utuh,sedang untuk yang berukuran besar,agar dapat mengawetkan sumsum di dalamnya dengan baik,sebaiknya dilakukan pemotongan baik melintang maupun membujur berukuran 5-10 mm terlebih dahulu.cairan fiksatif mengandung formalin atau yang mengandung 5-10 % larutann formalin sudah cukup sesuai untuk memfiksasikan tulang maupun jenis jaringan yang memerlukan proses dekalsifikasi.formalin mempunyai daya penetrasi yang baik dan melindungi bagian-bagian yang lembut terhadap daya kerja cairan pendekalsifikasi yang digunakan (Gunarso, 1989).
b. Spesimen berasal dari tumbuhan
Spesimen tumbuhan yang sedang tumbuh maupun yang sedang dalam proses perkembangannya dapat diperoleh langsung dari rumah kaca,kebun maupun ladang. Botol berisi larutan fiksasi harus dipersiapkan pada waktu pengambilan atau pengumpulan spesimen. Dapat pula tumbuhan atau bahan daripadanya secepatnya disimpan dalam air sebelum dilakukan proses fiksasi. Banyak jenis tumbuhan yang langsung layu begitu dipotong. Untuk hal ini sebaiknya selalu disiapkan cairan fiksatif pada waktu pengumpulan bahan spesimen tersebut (Gunarso, 1989).
c. Jenis jaringan patologis
Penyakit akan menyebabkan terjadinya kelainan pada jaringan.kelainan yang terjado tersebut merupakan hal yang penting pada penelaahan patologis. Baik spesimen hewan maupun tumbuhan umumnya memerlukan penelaahan secara mikroskopis untuk dapat mengidentifikasikan jenis penyakit yang menyebabkan kelainan patologis tadi. tumor dan infeksi merupakan penyebab utama terjadinya kelainan pada jaringan. Tumor pada manusia,hewan maupun tumbuhan umumnya tidak menular pada manusia. Sehingga tidak berbahaya dalam menanganinya. Bagian utama atau tertua sesuatu tumor biasanya merupakan jaringan yang sudah mati atau dalam proses kematian,sehingga bagian tersebut bukan merupakan bagian yang baik untuk menelaah perbedaan pertumbuhan normal dan tidak normal.
Dari embrio hewan dimungkinkan untuk mandapat hasil mikroteknik yang baik. Melalui sayatan melintang embrio tersebut dapat dilakukan penelaahan berbagai jenis jaringan (otot,saraf,epitelia,penghubung) sebagaimana cara yang terdapat pada hewan dewasa. Embrio berukuran kecil dapat difiksasi secara utuh. Embrio mamalia umumnya dikeluarkan dari rahim dan selaput pembungkusnya untuk kemudahan dimasukkan ke dalam cairan fiksatif. Embrio jenis hewan piaraan (babi,kambing dan lain-lain) pada tahap akhir (tahap fetal),akan selalu besar untuk difiksasi secara utuh sehingga memerlukan pemilihan dan penyayatan bagian jaringan yang dikehendaki. embrio tikus dan mencit memungkinkan untuk difiksasi secara utuh baik pada tahap fetal maupun yang baru lahir (Gunarso, 1989).
C. METODA MIKROTEKNIK
Metoda yang secara umum yang digunakan dalam mikroteknik adalah :
1. Sediaan utuh (Whole mounts)
2. Sediaan irisan (sectioning)
3. Sediaan uraian (teasing)
4. Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)
3. Sediaan supravital
Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts)
Dengan metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organisme (baik hewan maupun tumhuhan) secara utuh. spesimen kultur, organ, maupun bagian organ, embrio, sel telur, spermatozoa ,potongan syaraf,pembuluh darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui metoda ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format-format taga dimensinya. Yang menjadi pembatas adalah faktor ukuran, ketabalan, serta tingkat transparansi sediaan yang kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran pengamatan melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan transparan akan memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbasaran tidak lebih dari 30 kali. Sediaan dengan ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan mencapai tingkat perbesaran 100 kali.
Sediaan permanen dengan ketebalan 0,2 mm atau lebih yang telah di dehidrasidan diberi media pelekap memerluka adanya suatu penunjang gelas penutup agar spesimen tidak menjadi rusak dan gelas penutupnya sendiri tidak pecah karena proses pengeringan serta pengkerutan media tersebuut. Belakangan ini umum pula digunakan tabung plastik yang dipotong-potong secara melintang hingga dihasilkan cincin-cincin penunjang dengan ketebalan yang sesuai dengan tinggi serta ketebalan speimen. Tepi tempat pemotongan sebaiknya dihaluskan dengan mengunakan kerrtas amplas (Gunarso, 1989).
Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu. Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut masih hidup sehingga pengamatan yang dapat dilakukan hanya terbatas terhadap morfologi secara umum saja. Metode pembuatan preparat yang digunakan untuk pengamatan secara menyeluruh, artinya mempelajari struktur vegetatif dan reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman sebagai preparatnya. Tentu saja tanaman yang diamati haruslah berukuran kecil sehingga dapat termuat pada objek glass. Sedangkan pada tanaman yang agak besar bisa dilakukan pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil. Metode whole mounth mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing. Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)
Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin ataupun teknik bagi penyiapan spesimen histologi amaupun patologi. Tebal tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15 mikron (1 mikron = 0,001 mm). Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari saytaan pembuluh darah yang sangat kecil hingga sayatan otak. Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang lebar 2x3 cm karena ukuran yang demikian paling sesuai untuk direkapkan pada kaca preparat yang umum digunakan. Tentu saja ukuran spesimen yang cukup kecil akan mengjasilkan sayatan juga juga jauh lebih kecil dari ukuran sayatan tersebut.
Pengirisan atau penyayatan umumnya dilakukan dengan bantuan mikrotom, walau seringkali dilakukan penyayatan dengan tangan saja untuk jenis spesimen seperti tulang, gigi ataupun benda-benda fosil seringkali diperlukan gergaji untuk memotongnya. Mikrotom adalah jenis mesin khusus dirancang dan dipasarkan untuk tujuan mikroteknik. Mesin tersebut dirancang sedemikian rupa sehingga mampu untuk melakukan penyayatan sesuatu spesimen dengan ketebalan yang sama atau paling kurang mendekati sama (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations)
Pengertian teasing adalah menguaraikan. Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi dan mengalami pewarnaan
Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. Masing-masing biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan pengulasa atau penyebaran pada kaca preparat. Untuk jenis cairan yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya umumnya dicairkan dengan air atau serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10 (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Rentang
Pada metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa sehingga disamping jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan. Jenis bahan siapan yang uum direntang saat difiksasi adalah otot, syaraf, jenis jaringan tipis (selaput yang membungkus jantung, hati dan lain-lain) (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Gosok
Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan (kecuali bila mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya). Untuk mengatasi hal diatas tadi, maka umum juga dibuat sediaan dengan metoda gosok. Tulang misalkan tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga ukuran beberapa mili hingga 1 – 2 cm. Potongan tersebut kemudian digosok pada batu hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Supravital
Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka memungkinkan kita untuk mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang sangat cepat pada sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso, 1989).
Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah :
1. 1 tetes darah diteteskan pada kaca preparat
2. Teteskan pula 1 tetes zat warna (missal yanus green) dengan konsentrasi 0,25 dalam garam fisiologis
3. Tutup dengan kaca penutup
4. Biarkan selama 5 menit
5. Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup.
(Lasantha, 2010)
Metoda Sediaan Remasan (Squash)
Metode remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom baik hewan maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau dihancurkan sehingga masing-masing sel akan terlepas yang memudahkan pengamatan selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan berarti menghancurkan sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan tetap dipertahankan bentuk aslinya.
D. METODA PARAFIN
Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan normal sifatnya maupun yang mengidap suatu penyakit (patologis) akan lebih baik hasilnya dilakukan dari preparat jaringan yang telah dipersiapkan dengan baik, telah dillakukan penyayatan cukup tipis serta diberi pewarnaan yang sesuai, sehingga berbagai elemen yang diteliti lebih mudah untuk diamati (Gunarso, 1989). Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah sebagai berikut :
1. Sampling
Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling ini diambil beberapa organ sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka dipotong-potong terlebih dahulu.
Menurut Eching (2009) Pengambilan jaringan :
a) Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer
b) Pemotongan harus dengan pisau yang tajam
c) Ukuran potongan sebaiknya 1 cm
d) Secepatnya difiksasi
Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan pasca mati dan perubahan struktur lain yang dapat menyesatkan dalam pengamatan.
2. Fiksasi (fixation)
Tujuan utama fiksas adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan kata lain fiksasi bertujuan :
Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
Mencegah autolisis
Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif.
Pada garis besarnya berdasarkan komposisi bahannya suatu fiksatif dapat dikelompokkan menjadi :
Fiksatif tunggal
Hanya menggunakan satu bahan kimia umum dalam bentuk larutan
Contoh : formalin, alkohol, asam asetat dan asam pikrat.
Umumnya kurang memenuhi persyaratan sebagai fiksatif yang baik, terutama bagi tujuan mikroteknik
Masih umum digunakan untuk tujuan anatomi maupun histopatologi terutama fiksatif formalin.
Fiksatif majemuk
Umumnya berupa campuran dari beberapa fiksatif tunggal
Disusun dengan formula agar dapat diperoleh sesuai keinginan dan tujuan.biasanya fiksatif campuran ini dituliskan sesuai dengan nama penemu formulanya.
Banyak sekali fiksatif campuran yang ada, contoh : larutan Bouin,larutan FAA, larutan glison, dan lain sebagainya
3. Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam jaringan tisu dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupaka langkah penting yang memerlukan perlakuan yang prosesnya tidak terputus-putus. Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan terhalangnya proses penamanan dalam parafin yang merupakan proses lanjutan setelah proses dehidrasi tersebut. Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang kita gunakan hedaklah memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut :
Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air tersebut
Dehidran itu sendirir dapat digantikan kedudukannya oleh meduium penjernih
Tidak merusak danmengganggu tisu yang telah difiksasi sebelumnya sehingga misalnya tisu akan menjadi terlalu lunakkembali ataupun malah memperkeras tisu tersebut menjadi rapuh.
Dehidran yang paling umum dalam mikroteknik bagi metode parafin adalah alkohol. Dalam penggunaannya dipakai serangkaian alkohol dengan konsentrasi berbeda, dimulai dengan alkohol 35% - 50% - 70% - 80% - 95% - 100%. Alkohol 70% umum dikenal sebagai Stopping point dengan pengertian tisu dapat disimpan agak lama (biasanya dibiarkan bermalam untuk dilanjutkan pada keesokan harinya maupun hari-hari berikutnya).
4. Penjernihan (clearing)
Tujuan utama proses penjernihan adalah menggatiakn tempat alkohol dalam tisu yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum dilakukan proses penyayatan. Setelah kita menggunakan xylol atau benzene pada proses penjernihan ini, pada umumnya tisu akan menjadi transparan : hal ini yang menjadi alasan bahwa hal ini dikenal sebagai proses penjernihan. Lama tisu dalam medium penjernih bergantung pada :
Ketebalan serta tingkat kepadatan tisu
Jenis reagen yang dipakai
Untuk jenis tisu yang melalui proses dehidrasi dengan sempurna, maka proses penjernihan (xylol, benzene) berlangsung selama setengah hingga tiga jam. Bila tisu dibiarkan cukup lama dalam medium penjernih ini, maka besar kemungkinan tisu akan menjadi keras dan rapuh yang tentu menyukarkan dalam penyayatan.
5. Infiltrasi (infiltration)
Yang dimaksud dengan infiltrasi yaitu usaha menyususpkan media penanaman kedalam tisu dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media penamanam/embedding yang umum dipakai adalah parafin. Parafin dibedakan berdasarkan titik didihnya, jadi ada yang bertitik didih 48°C, 54°C, 56°C dan 58°C. Utuk jenis tisu hewan yang biasanya digunakan parafin bertitik didih 58°C. Sebelum jaringan masuk kedalam parafin murni maka tisu terlebih dahulu berada dalam xylol : arafin dengan perbandingan 1:3, 1:1, 1:3 da selanjutnya masuk kedalam parafin murni.
6. Penanaman (embedding)
Penanama merupaka proses memasukkan atau menanam tisu kedalam blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Beberapa teknik percetakan tersebut menggunakan :
a. Cetakan terbuat dari timah atau logam berat lainnya yang berbentuk L dialas kaca dengan cara ini satu persatu tisu akan dapat dicetak.
b. Cetakan terbuat dari kertas. Sebaiknya disiapkan dari bahan kertas karton atau manila
c. Cetakan berbentuk bak yang terbuat dari aluminium, dengan cara ini tisu dapat ditanamkan sekaligus.
7. Pemotongan (section)
Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh..
Mikrotom
Alat khusus yang diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop. Untuk memperoleh hasil sayatan yang baik dibutuhkan beberapa persayaratan sebagai berikut :
1. Tisu yang telah dipersiapkan dengan sempurna
2. Pisau yang cukup tajam
3. Pemilihan jenis mikrotom yang tepat
4. Operator yang cukup terampil dan terlatih
Dari beberapa jenis mikrotom yang ada, jenis-jenis mikrotom yang umum dikenal dan digunakan dalam mikroteknik :
a. Mikrotom putar
Umum dipakai untuk mikroteknik metode parafin. Posisis kedudukan pisau tetap. Sedang tisulah yang dilekat pada tisu holder yang bergerak turun naik sehingga diperoleh sayatan umumnya berbentuk pita.
b. Mikrotom sorong
Sering pula digunakan dalam metode parafin, walau umumnya digunakan untuk penyayatan tisu yang ditanam dalam celloidin. Dalam penggunaanya kedudukan tisu ditetapkan atau diam, sedangkan pisaunya yang bergerak maju mundur.
c. Mikrotom beku
Mikrotom beku digunakan untuk penyayatan tisu yang tidak ditanam dalam parafin maupun dalam celloidin. Jadi tisu yang disayat adalah tisu yang tidak ditanam, walau umumnya telah difiksasi dalam formalin dan dibekukan dengan karbondioksida ataupun freon.
8. Afiksasi (afixing)
Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan atau penetapan sayatan tisu yang pada kaca preparat dengan bantuan media prekat tertentu. Pada proses ini diperlukan berbagai persiapan antara lain :
a. Kaca preparat bersih
b. Media prekat
c. Akuades
d. Meja pemanas/hot plate
e. Peralata berupa pinset, skapel, gunting, kuas dan lain sebagainya.
Dari beberapa jenis formula media prekat yang umum digunakan dalam kerja rutin adalah media merekat albumin. Mula-mula putih telur dan gliserin dikock hingga rata, busa yang terjadi dibuang dan bila perlu dilakukan penyaringan, kemudian dibubuhkan kristal-kristal thymol yang berfungsi sebagai pencegah berkembangnya jamur dan bakteri serta beberapa tetes akuades sebagai pengencer.
9. Deparafinisasi
Deparafinisasi adalah proses penghilangan parafin menggunakan xylol. Adapun langkah-langkah deparafinisasi adalah :
Jaringan dimasukkan kedalam xylol (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 30 menit
Redehidrasi dengan alkohol dari tinggi ke rendah (100%, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) kemudian cuci dengan air mengalir setelah itu celupkan ke dalam akuades.
10. Pewarnaan (staining)
pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen tisu, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan dalam pembuata preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan Hematoxilin-eosin.
Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan terlebih dahulu dan setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan kesukaran, karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari pada pewarna paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin. Adapun langkah-langkah pewarnaan adalah :
a) Dilakukan dengan pewarnaan hematoxilin selama 13 detik
b) Cuci dengan air mengalir
c) Bilas dengan akuades
d) Masukkan kedalam alkohol 30%, 40%, 50%, 60% da 70%
e) Bilas dengan akuades
f) Warnai dengan eosin selama 1-2 menit
g) Celupkan kedalam xyloll (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 20 menit.
11. Mounting
Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda parafin. Sebelum ditutup secara permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada mikroskop apakah jaringan tersebut sudah dapat diamati dengan baik atau tidak. Pada mounting tutup dengan canada balsem dan gelas penutup. Hindari terbentuk gelembung udara kemudian beri label dan diamati kembali diwabah mikroskop.
DAFTAR PUSTAKA
Amar. 2008. Materi Mikroteknik. http://amar1286.multiply.com/journal/item/10 (di unduh tanggal 20 juni 2011)
Eching. 2009. Mikroteknik. http://yessyrumengan.blogspot.com/2009/11/histologi-mikroteknik.html (di unduh tanggal 20 juni 2011)
Gunarso, Wisnu. 1989. Bahan Pengajaran Mikroteknik. Bogor : DEPDIKBUD Institiut Pertanian Bogor
Lasantha. 2010. Metode Mikroteknik. http://freematerikuliah.blogspot.com/2010/11/metode-mikroteknik.html (di unduh tanggal 20 juni 2011)
Tim Penyusun. 2011. Penuntun Praktikum Mikroteknik. Pontianak : FKIP UNTAN
Zaifbio. 2010. Preparat Wholemount Kutu Daun Bunga (Triboliun Confusum). http://zaifbio.wordpress.com/category/mikroteknik/ (di unduh tanggal 20 juni 2011)
